Science:RNA疫苗讓claudin-CAR-T細(xì)胞更有效地抵抗實(shí)體瘤
盡管用經(jīng)過(guò)基因改造后表達(dá)嵌合抗原受體(CAR)的T細(xì)胞(CAR-T細(xì)胞)治療B細(xì)胞惡性腫瘤的臨床應(yīng)用取得了成功,但是細(xì)胞因子釋放綜合征(CRS)卻阻礙了這種療法在患者中的有效性。眾所周知,CRS是由急性炎癥反應(yīng)觸發(fā)的,其特征是發(fā)燒、低血壓和與血清細(xì)胞因子升高有關(guān)的呼吸功能不全。盡管人們已報(bào)道在經(jīng)過(guò)CAR-T細(xì)胞治療的人源化小鼠模型中,巨噬細(xì)胞參與了CRS的發(fā)病機(jī)制,但觸發(fā)CRS的機(jī)制尚不清楚。輸注到患者體內(nèi)的CAR-T細(xì)胞經(jīng)歷活化和增殖,快速增殖的CAR-T細(xì)胞可能會(huì)在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致B白血病細(xì)胞迅速大量死亡。巧合的是,急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者的疾病負(fù)擔(dān)也與CRS的發(fā)生率和嚴(yán)重程度密切相關(guān)。如此大規(guī)模的惡性B細(xì)胞死亡參與CRS發(fā)病機(jī)制的方式仍不明確。
細(xì)胞可以經(jīng)歷不同類(lèi)型的死亡。細(xì)胞凋亡初被認(rèn)為是少有的受到調(diào)控的程序性死亡形式。但是,近期研究已證實(shí)了一種以前未被識(shí)別的程序性壞死,其特征是細(xì)胞快速腫脹、質(zhì)膜上出現(xiàn)較大的氣泡以及促炎因子釋放。至少已鑒定出兩種程序性壞死細(xì)胞死亡途徑,包括MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡(necroptosis)和GSDMD(Gasdermin D)或GSDME(Gasdermin E)介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡(pyroptosis)。將RIPK1招募到TNF-α受體上可與RIP3形成一種死亡復(fù)合物,隨后產(chǎn)生膜納米孔,從而導(dǎo)致壞死性凋亡。不同于MLKL的是,GSDMD或GSDME由炎性半胱天冬酶(caspase 1、caspase 4、caspase 5和小鼠caspase 11)或caspase 3激活,可產(chǎn)生插入到細(xì)胞膜中的寡聚物而形成納米孔,因而介導(dǎo)細(xì)胞焦亡。
在一項(xiàng)新的研究中,來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、鄭州大學(xué)、華中科技大學(xué)和北京大學(xué)的研究人員提供的證據(jù)表明,人類(lèi)B白血病細(xì)胞和其他靶腫瘤細(xì)胞表達(dá)了足夠數(shù)量的GSDME,所表達(dá)的GSDME可被由CAR-T細(xì)胞釋放的顆粒酶B激活的caspase 3高效激活,從而導(dǎo)致靶細(xì)胞遭受細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡釋放的因子刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子,這很可能觸發(fā)接受CAR-T細(xì)胞治療的患者中發(fā)生的CRS。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2020年1月17日的Science Immunology期刊上,論文標(biāo)題為“Gasdermin E–mediated target cell pyroptosis by CAR T cells triggers cytokine release syndrome”。
這些研究人員發(fā)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞由于釋放大量穿孔素和顆粒酶B而激活了B白血病細(xì)胞中的caspase 3-GSDME途徑,從而導(dǎo)致細(xì)胞焦亡和隨后的CRS。已觀察到CAR-T細(xì)胞經(jīng)歷增殖過(guò)程并在體內(nèi)的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)達(dá)到極高的增殖頻率。因此,在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi),大多數(shù)靶細(xì)胞可能會(huì)經(jīng)歷細(xì)胞焦亡,導(dǎo)致受到激活的巨噬細(xì)胞通過(guò)活化的caspase 1產(chǎn)生IL-6和IL-1β,從而觸發(fā)CRS。闡明這種分子機(jī)制為CRS嚴(yán)重程度與CAR-T細(xì)胞在治療期間的數(shù)量和B白血病細(xì)胞負(fù)荷有關(guān)的臨床觀察提供了深刻的見(jiàn)解。
在人類(lèi)B白血病細(xì)胞、MCF-7乳腺癌細(xì)胞和小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞中檢測(cè)到GSDME表達(dá)是出乎意料的,這是因?yàn)樗鳛橐环N孔形成蛋白發(fā)揮作用,而且它的激活是潛在危險(xiǎn)的,并且可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。據(jù)報(bào)道,GSDME在許多受檢的腫瘤細(xì)胞系中不表達(dá)。與此相一致的是,GSDME基因的啟動(dòng)子區(qū)域顯示出高甲基化狀態(tài),這就表明GSDME基因在細(xì)胞中遭受表觀遺傳沉默。 GSDME被認(rèn)為是一種通過(guò)caspase 3裂解誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的腫瘤抑制基因,并且腫瘤細(xì)胞可能已進(jìn)化出表觀遺傳學(xué)手段來(lái)沉默GSDME表達(dá),從而允許腫瘤發(fā)生。然而,GSDME在B白血病細(xì)胞和其他腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)提示著GSDME很可能在腫瘤細(xì)胞的孔形成中發(fā)揮替代作用。人們目前正在研究GSDME表達(dá)克服高甲基化調(diào)控的方式以及GSDME是否具有除孔形成以外的常規(guī)功能。
這項(xiàng)研究的重要發(fā)現(xiàn)是CAR-T細(xì)胞比未轉(zhuǎn)導(dǎo)的天然T細(xì)胞釋放更多的穿孔素/粒酶B。T細(xì)胞釋放溶細(xì)胞性效應(yīng)分子取決于兩種信號(hào)的激活:MHC-抗原肽-TCR(信號(hào)1)和CD80/CD86-CD28(信號(hào)2)。信號(hào)2的完全激活取決于TCR信號(hào)的激活強(qiáng)度。TCR信號(hào)激活的輕鏈激酶(LCK)使得CD28酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化;與此同時(shí),TCR信號(hào)激活的LAT和SLP-76磷酸化和激活關(guān)鍵的CD28下游信號(hào)分子PLC-γ,因而將磷脂酰肌醇4,5-雙磷酸(PIP2)降解為二酰甘油(DAG)和1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)。
基于對(duì)T細(xì)胞激活的了解和基因工程取得的進(jìn)步,這些研究人員設(shè)計(jì)出針對(duì)人類(lèi)T細(xì)胞的合成CAR。設(shè)計(jì)CAR的基本概念是將單鏈可變區(qū)片段(scFv)與CD3ζ細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊連接在一起,以在抗原結(jié)合后誘導(dǎo)T細(xì)胞激活。當(dāng)前,這種模塊化結(jié)構(gòu)已從單個(gè)CD3ζ信號(hào)結(jié)構(gòu)域擴(kuò)展到CD3ζ-CD28、CD3ζ–4-1BB或CD3ζ–CD28–4-1BB信號(hào)結(jié)構(gòu)域,以模擬信號(hào)1和信號(hào)2。
鑒于CAR與其抗原之間的親和力可能比TCR與MHC-肽復(fù)合物之間的親和力高100倍,因此這種優(yōu)越的親和力加上共刺激信號(hào)使得CAR-T細(xì)胞能夠釋放大量的穿孔素/粒酶B,這是CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞焦亡所必需的。一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后,顆粒酶B可以將caspase 3的無(wú)活性前體(procaspase 3)裂解為它的活性形式?;罨腸aspase 3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或裂解GSDME,這種裂解通過(guò)膜孔形成觸發(fā)細(xì)胞焦亡。但是,細(xì)胞具有快速修復(fù)質(zhì)膜中形成的孔的能力。GSDME是否觸發(fā)細(xì)胞焦亡取決于膜孔形成與膜修復(fù)之間的平衡。盡管具有相同的GSDME數(shù)量,但是天然的TCR CD8+ T 細(xì)胞僅導(dǎo)致低水平的GSDME裂解,而CAR-T細(xì)胞釋放出更高水平的穿孔素/粒酶B,因而導(dǎo)致更多的GSDME激活。
由于釋放富含損傷相關(guān)分子模式(DAMP)分子的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物,細(xì)胞焦亡中發(fā)生的裂解具有高度促炎性。在這項(xiàng)研究中,這些研究人員證實(shí)腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷的細(xì)胞焦亡導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中的caspase 1和GSDMD激活,從而導(dǎo)致大量促炎細(xì)胞因子的釋放和CRS的發(fā)生。在這些促炎細(xì)胞因子中,IL-6和IL-1β尤為重要。臨床上,中和IL-6的抗體被廣泛用于預(yù)防和/或治療接受CAR-T細(xì)胞治療的患者中發(fā)生的CRS。作為多效細(xì)胞因子,IL-6主要受到NF-κB、AP-1和STAT3等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。諸如脂多糖(LPS)之類(lèi)的病原體相關(guān)分子模式(PAMP)分子和諸如熱休克蛋白(HSP)和HMGB1之類(lèi)的DAMP分子可通過(guò)激活這些轉(zhuǎn)錄因子來(lái)刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6。
這些研究人員發(fā)現(xiàn)HMGB1存在于焦亡細(xì)胞(經(jīng)歷細(xì)胞焦亡的細(xì)胞)的上清液中,因而直接激活巨噬細(xì)胞中的IL-6。 IL-1β是以前體形式合成的,它的釋放取決于caspase 1的激活,caspase 1是一種受到炎性體嚴(yán)格調(diào)節(jié)的促炎性半胱天冬酶。炎性體NLRP3已被包括微生物毒素、顆粒物、晶體、β-淀粉樣蛋白聚集物或細(xì)胞外ATP在內(nèi)的多種刺激物廣泛激活。
在這項(xiàng)研究中,這些研究人員發(fā)現(xiàn)焦亡細(xì)胞的上清液含有ATP,用P2X7受體拮抗劑處理或降解ATP可抑制焦亡細(xì)胞的上清液激活巨噬細(xì)胞中caspase 1的能力。在他們開(kāi)發(fā)的小鼠CRS模型的幫助下,他們進(jìn)一步證實(shí)不論是敲除靶腫瘤細(xì)胞中的GSDME,也不論是剔除巨噬細(xì)胞,還是抑制caspase 1/GSDMD都可阻止CRS的發(fā)生。闡明這種分子途徑對(duì)于更好地了解與CAR-T細(xì)胞療法相關(guān)的毒性至關(guān)重要。2018年,Verena Staedtke等人已發(fā)現(xiàn)兒茶酚胺阻斷劑可以抑制巨噬細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子。因此,對(duì)GSDME和兒茶酚胺的聯(lián)合阻斷可以在不降低腫瘤清除的情況下更好地治療CRS。
盡管這項(xiàng)研究報(bào)道CAR-T細(xì)胞通過(guò)GSDME依賴(lài)性途徑誘導(dǎo)靶腫瘤細(xì)胞遭受細(xì)胞焦亡,但也可能存在其他途徑來(lái)介導(dǎo)CAR-T細(xì)胞引起的靶細(xì)胞焦亡。近期研究已報(bào)道CAR-T細(xì)胞可能動(dòng)員TNF-α來(lái)介導(dǎo)這種殺傷過(guò)程,不過(guò)這可能與顆粒酶B和穿孔素?zé)o關(guān)。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)的一種可能性是CAR-T細(xì)胞可以使用一種兩步驟策略來(lái)攻擊靶細(xì)胞。顆粒酶B和穿孔素引發(fā)了一波殺傷,如果靶細(xì)胞逃脫了一波攻擊,那么TNF-α就會(huì)發(fā)起第二波殺傷。這也可能解釋了為何細(xì)胞焦亡可在不顯著影響CAR-T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷作用的情況下可被阻斷。當(dāng)前的這項(xiàng)研究揭示了CAR-T細(xì)胞和天然的TCR-T細(xì)胞導(dǎo)致的細(xì)胞死亡類(lèi)型之間存在機(jī)制上的差異,這就為通過(guò)將腫瘤細(xì)胞死亡從細(xì)胞焦亡切換到細(xì)胞凋亡來(lái)修飾CAR以減少CRS提供了機(jī)會(huì)。(生物谷 Bioon.com)
參考資料:Yuying Liu et al. Gasdermin E–mediated target cell pyroptosis by CAR T cells triggers cytokine release syndrome. Science Immunology, 2020, doi:10.1126/sciimmunol.aax7969.
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